1597年，利玛窦被任命为中国传教的主管。
1598年6月25日利玛窦与另一位郭居静神父同王忠铭一起离开南昌奔赴南京。
1598年7月初，他们一行到达南京，1598年，利玛窦首次进京是由南京礼部尚书王忠铭促成的。王忠铭是利玛窦在韶州传教时结识的老友，当时正要赴北京述职。
时值万历皇帝寿诞，王忠铭便邀请利玛窦一同进京贺寿，利玛窦也准备了自鸣钟、八音琴等欧洲方物献予皇帝。一行人由水路启程离开南京，沿大运河北上。
1598年9月7日利玛窦历经两个月后到达北京。漫长的旅途加之夏日的酷热，使传教士们一度病倒，而初到北京的喜悦，又令他们忘却了旅途的艰辛。利玛窦在札记中写道：“这真是一桩令人欣喜的事，我们不应缄默着把它放过去；只要想想基督信仰跨过多少海洋，经过这样长时期的接近之后，终于进入这个国度，它的使者终于进入了皇都。”然而，之后的事情远不如利玛窦想像中的顺利。由于当时正值日本侵犯朝鲜的战争，整个京城戒备森严、气氛紧张，人们都怕因结交洋人而惹祸上身。先是王忠铭联系的太监拒绝将利玛窦引入皇宫，随后王忠铭本人也不再施以援手。
利玛窦虽然想方设法在京周旋，但仍四处碰壁，就连昔日老友也对他避而不见。利玛窦作为外国人无法在北京久留，而且又遇到了财政上的困难，仅住一个多月只得返回南京。虽然未能见到皇帝，但利玛窦首次北京之行收获颇丰。他首先证明了《马可波罗游记》中记载的契丹就是中国，而国都“汗八里”即是北京。在旅程中，利玛窦还与神父郭居静一同编修了第一本中西文字典《平常问答词意》，首次尝试用拉丁字母为汉字注音。此外，他还完成了对《四书》的翻译和注释工作，这对中国文化向西方传播起到了重要的作用。
利玛窦于1599年2月6日在南京定居。并建立了第四个传教驻地。
在南京居住期间，利玛窦通过瞿太素的帮助，结交了不少名士，如南京礼部侍郎叶向高、思想家李贽、徐光启等。当然这主要还是人们对于他的自然科学知识的倾慕。值得一提的是，在南京利玛窦还与一位三淮和尚进行了一场辩论，在这次辩论中，利玛窦凭借其科学性的思辨明显占了上风。
他还在正阳门内洪武岗西崇礼街建成内地第四座天主教堂，他在城西罗寺转湾的住址后来也成为着名的天主教堂——石鼓路天主教堂。这些活动使南京成为中国天主教史上最重要的传教中心之一。
1600年，接受了新任务的利玛窦开始策划北京之行。没过多久，他就联系了北上任南京礼部尚书的王忠铭一起带他去南京，而且王忠铭还表示要带他去北京。
1600年5月18日（万历二十八年），利玛窦带着庞迪我神父和准备好献给皇帝的礼物由南京启程再赴北京，由于太监马堂的讹诈和阻挠，传教士们在天津耽搁了近半年的时间，并于1601年1月24日抵达北京。
利玛窦一到北京，就着手整理礼物进献皇帝。进呈自鸣钟、圣经、《万国图志》、大西洋琴等礼单上开列的贡品共16件，万历皇帝对这些贡品兴趣十足，对那些宗教圣物，万历皇帝既觉新奇又感敬畏，他把十字架上的耶稣称为“活神仙”，并把圣母像送与母亲慈圣太后。
对大小两架自鸣钟，万历皇帝最为喜爱，小的那架被他带在身边时常把玩；大的那架，被置于精美的阁楼之中，在宫内专司报时。由于自鸣钟构造复杂，需要时常维护，传教士们便被允许定期进宫对其进行检修。对利玛窦进奉的西洋琴，万历皇帝也备感好奇，他命利玛窦教太监演奏。利玛窦让助手庞迪我教授太监，他自己则仿照宗教赞歌的形式创作了8首乐曲，并填上简短的中文歌词，起名《西琴八曲》。每当悠扬的琴声在宫中回荡时，万历皇帝就会想起这位来自西洋的神甫。正是这些“欧洲方物”打开了利玛窦进入宫廷的大门，万历皇帝也因此对他赏识有加，允许其留居北京，深得信任。
1601年，明神宗下诏允许利玛窦等人长居北京，作为欧洲使节被召命带进北京紫禁城。至此他将一直拥有朝廷的俸禄，直到临终。但大明朝廷根本没有注意到，利玛窦长住北京的目的是为了传播基督教。
利玛窦在北京以丰富东西学识，结交中国的士大夫。常与宾客谈论天主、灵魂、天堂、地狱，同时编撰新书。1602年-1605年，出版《两仪玄览图》第三版中文世界地图，以及其他着作《天主实义》、《天主教要》和《二十五言》，得到不少中国知识分子的尊重。
到了1605年，北京已有200人信奉天主教，当中有数名更是公卿大臣。这当中最着名的，也是后来对利玛窦传教事业帮助最大的，当属“圣教三柱石”——徐光启、李之藻和杨廷筠。
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